RNAi与CRISPR 两大创新技术如何擦出火花 | 遇见Roderick Beijersbergen

研发客 研发客 2019-06-07



翻译 | 胡小洁


基因筛选是经典的生物学研究方法之一,常被用于鉴定某种生物学反应中起到重要作用的基因。自从21世纪初人类基因组图谱的研究获得根本性突破后,有关基因筛选的应用前景便引起了学界广泛的关注和期待。十多年来RNAi一直是这一领域的王者,应用RNAi可以特异性关闭特定基因的表达,所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。然而,新兴技术(特别是CRISPR)后来者居上,似有动摇和赶超RNAi统治地位的势头。


而来自荷兰癌症研究所的Roderick Beijersbergen教授是为数不多能够同时驾驭RNAi 与 CRISPR两种技术并能通过混合运用两种技术进行大规模筛选,效果达到一加一大于二的人之一。


Roderick Beijersbergen教授


Beijersbergen教授现任荷兰癌症研究所的高通量筛选研究组组长、NKI机器人和筛查中心主任。在过去几年间,他专注于功能性基因的筛选,特别是那些基因功能丧失细胞的基因筛选。为了实现这一筛选目标,他开发了一系列种类多样的shRNA敲低载体。这些技术,为进行大规模哺乳动物体细胞遗传学实验提供了可能性。


为了能够进行大规模的筛选,他建立了NKI机器人和筛选中心(NSRC)。该平台具有最先进的图像分析软件和数据库开发与统计分析的能力,结合生物信息学,可以针对大量具有复杂表型的细胞进行研究,有助于基因组工具和化合物的大规模与高通量的收集。


Beijersbergen教授的研究小组首创了新的整合RNAi筛选技术,该技术现已扩展到可用于CRIPSR/CAS9基因组编辑的筛选。这些新的整合RNAi筛选技术已带来了癌症治疗新靶点的发现,增加了对新药作用机制的理解,以及发现通路靶向疗法耐药性的新机制。基于这些大规模筛查研究的帮助,他的研究团队现已建立了创新的癌症治疗组合,目前几项临床试验正在进行。


Beijersbergen教授将会在本月召开的第三届北大生物医学创新国际论坛上作出相关的主题演讲,研发客在会前采访了Beijersbergen教授。


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研发客:什么是混合RNAi筛选? 与当前的筛选技术相比,它有哪些优劣势?


Beijersbergen:

RNA干扰可用于敲低个体基因的表达,进而对细胞特征(例如生长和药物反应)的敲低效应(Knockdown)进行研究。要研究多个个体基因失活的后果,需要进行多项高通量实验。相比之下,混合RNAi筛选可以对多个基因甚至是全基因组在单个实验中进行筛选。基因表达失活是由稳定整合于细胞基因组中的病毒构建体的shRNA表达所引起的。基于如增殖、存活率或药物反应等要素选择群体之后,可通过对病毒编码shRNA的深度测序来分析群体中每个个体shRNA盒的相对丰度。当参与失活导致抗性时,那些在种群中耗尽的shRNA被敲低,这是生长和存活所需的。混合RNAi筛选技术可以相对容易地用于多种不同细胞表型的筛选。


RNAi筛选的优点在于,经鉴定的基因在许多情况下与所需表型有着直接的因果关系。在敲低激发一个受临床关注的表型的情况下(如再次致敏的抗药性细胞),编码蛋白质可作为药物靶标。混合筛选方法可被应用于不同的细胞系和全基因组,以便捷的技术有效地探索各个领域,发现临床靶点。


Source:Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference Nucleic Acids Research, 2015, Vol. 43, No. 7



研发客:我们是否已经通过RNAi筛选技术找到了新的靶点?你们是否已在与生物制药公司合作,将研究结果转化为新的治疗方案?


Beijersbergen:

混合RNAi筛选已应用于解决重要临床问题的模型之中。例如对尚无临床效果的药物进行的合成致死反应研究——BRAF-突变结肠直肠癌中的BRAF抑制剂。通过混合RNAi筛选,我们发现,表皮生长因子受体(EGFR)敲低使直肠肿瘤细胞对BRAF抑制剂产生敏感。BRAF和EGFR抑制剂组合已显示对患者有效。最近,联合MEK抑制剂进行治疗的III期临床试验已经结束,另外,其他一些筛选也找到了新的药物组合,它们可以重新敏化或增强对现有药物的应答。我们正在与制药公司合作,致力于针对特定类型的癌症寻找新型的生物标记物。


研发客:RNAi筛查在临床研究和应用中面临的挑战是什么?

Beijersbergen:

RNAi筛查已经存在了十多年。很明显,尽管这项技术非常强大,但因为RNAi试剂存在着不可预测的脱靶效应,这一技术的应用仍然是个挑战。此外,RNAi会导致基因表达的部分敲低,其变化可能会很大,从而使大规模RNAi筛选的应用复杂化。然而,通过多年的研究,我们已经对RNAi筛选的局限性有所了解,并仍然认为它是研究多种细胞表型的有力工具。


研发客:CRISPR在这个过程中的作用是什么?


Beijersbergen:

如上所述,RNAi会导致基因(部分)敲低以及脱靶效应。最近开发的CRISPR-CAS9技术可以通过改变DNA来完全敲除基因,从而去除基因表达。此外,CRISPR-CAS9基因组编辑具有更少的脱靶效应,使得对结果的演绎更加直接。有趣的是,CRISPR-CAS9基因组编辑由含有基因特异性序列的短RNA(sgRNA)所引导,这个短RNA伴随着一个可以促进与CAS9相结合的TRACR序列。该sgRNA序列的用途与shRNA序列类似,可以从大量不同的sgRNA中鉴别出个体细胞。这也使得在单个实验中,对基因组范围内的sgRNA集合进行CRISPR筛选成为可能。由于CRISPR的结果是完全敲除,因此观察到的表型会更强、更稳健,简化了随后的演绎和跟进步骤。但是,我们要知道的是,临床上,药物对靶点的作用并不都是使靶点失活,这一点更符合RNAi 的特性。


Source:Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference Nucleic Acids Research, 2015, Vol. 43, No. 7


研发客:如果不使用CRISPR,还能发现RNAi吗?


Beijersbergen:

如上所述,两种技术具有不同的特征。在许多项目中,需要同时使用两种技术,以夯实观察的结论。RNAi的第一个优点就是能够逆转敲低表型。然而,现在产生了CAS9的突变形式,它不再切割DNA,而是融合到转录抑制结构域中。该复合蛋白可作为特殊基因置于启动区域中,它所使用的sgRNA成为该区域的补充,引起基因的局部转录抑制。通过使用CRISPR干扰(CRISPRi)技术,人们可以用可逆的方式敲低表达,而不会出现应用RNAi时的脱靶效应。


研发客:这项技术有什么局限吗?


Beijersbergen:

大规模混合筛查的挑战在于精确细胞筛选模型的开发。多年来,有多个模型被建构,包括3D培养系统、共同培养系统甚至大规模体内筛选。除了需要开发正确的系统来解决当前的问题之外,可以说这一技术没有任何局限。


研发客:对于肿瘤或其他领域的治疗,这项技术是否更加适宜?


Beijersbergen:

RNAi或CRISPR混合筛选技术可以应用于多个不同的治疗领域。在肿瘤领域的研究已经十分广泛,因为许多表征类型是以细胞增殖或存活率为基础的,从而简化了对所需表型细胞的选择。然而,近来多个不同系统被应用于抗体染色、选择所需的表型细胞、单个细胞排序整合以及混合CRISPR筛选,大大扩展了其工具箱功能。


研发客:能否就您将在PKU全球论坛上所做的演讲稍做些介绍?


Beijersbergen:

在CRISPR screens. 北京大学全球论坛上,我将重点介绍我们在应用大规模混合RNAi和CRISPR筛选方面所取得的成功,并就我们最近使用大规模CRISPR筛查鉴定肝细胞癌新靶点的一些工作进行讨论。





总第793期

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