Cell | 线粒体自噬测量新工具:mito-SRAI

BioArt BioArt 2020-05-23

撰文 | 十一月

责编 | 兮


线粒体功能失调造成功能异常的线粒体的累积,进而引发多种人类疾病的产生。而线粒体自噬会通过溶酶体降解的方式将这些异常的线粒体移除从而维持细胞存活,引发了人们的广泛关注。但是现有的线粒体自噬探针存在特异性不足、使用条件限制较大以及对于大规模药物筛选方面无能为力的问题。


2020年5月20日,日本RIKEN脑科学研究中心Atsushi Miyawaki研究组联合武田药品工业株式会社Yoshiyuki Tsujihata研究组在Cell上发表Resource文章,题为Visualizing and Modulating Mitophagy for Therapeutic Studies of Neurodegeneration,将目光聚集在了如何开发一种性质稳定且能够同时用于活体成像以及固定样品成像的线粒体自噬测量工具,在进行耐酸性荧光蛋白的筛选、优化以及体内体外的检测后,开发了一种信号滞留型自噬指示器mito-SRAI,该指示器定位于线粒体上,能够测量线粒体自噬情况,同时作者们发现可以将mito-SRAI应用于高通量体外以及帕金森小鼠模型中筛选线粒体自噬的化学诱导剂。



为了检测自噬情况,需要涉及到将生物分子运送到溶酶体中,所以很多研究中会将两种不同颜色的荧光蛋白串联融合到目的蛋白之上【1】。大多数情况下,自噬检测中应用到的荧光蛋白是EGFP和mCherry。两种荧光蛋白对于溶酶体的酸性环境有着不同的敏感性,EGFP对溶酶体的酸性环境敏感而mCherry并不受影响,这两种荧光蛋白的不同特性可以用于检测溶酶体运输的能力与现象。线粒体自噬是线粒体通过自噬过程被选择性降解【2】。虽然理论上可以通过自噬探针标记线粒体来监测线粒体自噬,但在实践中很难实现探针的完全线粒体定位。


2011年,作者们曾经开发过一个线粒体自噬的探针,被称为mt-mKeima【3】。在实验中使用mt-mKeima的话,实验人员需要在观察前一天停止基因表达从而确保能够很好地提高该探针的特异性。但是mt-mKeima有一个很大的局限性是该探针具有可逆的酸敏感性,因而只能用于活体样品的线粒体自噬过程。因此,想要建立以一个稳健的、特异性高的线粒体自噬探针,作者们首先需要找到一个耐酸性的荧光蛋白。


作者们对一个来源于珊瑚虫的野生型和突变型的荧光蛋白文库进行了筛选,获得了一种CFP,在pH7环境中能够保持荧光活性,同时在pH 4-5也能表现出完全的荧光,这与溶酶体腔内的酸性相对应。为了监测固定生物样本的自噬,当溶酶体膜上的pH梯度消失时,需要考虑溶酶体内的荧光蛋白降解以及不可逆的酸变性。作者们发现,此CFP能够在pH 4.0的酸性条件下,37℃孵育18小时的情况下保持完全的荧光。因此,作者最终将该荧光蛋白称为TOLLES(TOLerance of Lysosomal EnvironmentS)


图1 线粒体自噬探针的组成以及工作原理


作者们进一步设计了一个串联载体,将YFP-TOLLES连接在一起,方便在在荧光能量共振转移实验中分别作为受体分子(Receptor)与供体分子(Donor)使用。在对两种荧光蛋白之间的linker序列进行优化之后,并连接线粒体基质特异性定位蛋白序列之后,作者们得到了一个能够最终作为线粒体自噬的探针系统:mito-SRAI(图1)。该系统在活体样品以及多聚甲醛固定样品中均能够有效的指示出线粒体自噬的情况,可以对线粒体自噬进行定量监测。通过线粒体自噬诱导药物CCCP(Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone)处理后,细胞中出现明显的线粒体自噬信号。


因为线粒体吞噬作用涉及选择性地清除受损的线粒体,线粒体与衰老和许多人类疾病有关【4】,因此一直以来对于线粒体自噬诱导剂的病理学需求呼之欲出。帕金森致病机理可能是PINK和Parkin基因的突变导致两种蛋白诱导线粒体自噬的能力受到影响。因此,作者们希望进行一个高通量的化合物筛选,以同时表达mito-SRAI/Parkin的小鼠细胞作为筛选对象,找到Parkin依赖的、但是对线粒体正常功能没有影响的线粒体自噬诱导剂。通过对76,000个化学药物进行筛选后,作者们找了一个化合物T-271,发现该化合物能够在Parkin依赖的情况下诱导线粒体自噬的产生同时并不影响线粒体的电势以及细胞外酸化速率等功能性参数。因此,mito-SRAI可以作为系统性筛选线粒体自噬诱导药物的平台。


总的来说,Miyawaki研究组联合武田药品工业株式会社合作开发的线粒体自噬指示器mito-SRAI能够有效地监测活体样品以及固定样品中线粒体自噬的情况,同时该指示器也可以作为高通量筛选线粒体自噬相关药物的实验平台,为线粒体自噬相关的研究提供了重要的工具。



原文链接:
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.04.025


制版人:珂



参考文献



1. Kuma, A., Komatsu, M. & Mizushima, N. Autophagy-monitoring and autophagy-deficient mice. Autophagy 13, 1619-1628, doi:10.1080/15548627.2017.1343770 (2017).

2. Pickles, S., Vigie, P. & Youle, R. J. Mitophagy and Quality Control Mechanisms in Mitochondrial Maintenance. Curr Biol 28, R170-R185, doi:10.1016/j.cub.2018.01.004 (2018).

3. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T. & Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & biology 18, 1042-1052, doi:10.1016/j.chembiol.2011.05.013 (2011).

4. Whitworth, A. J. & Pallanck, L. J. PINK1/Parkin mitophagy and neurodegeneration-what do we really know in vivo? Current opinion in genetics & development 44, 47-53, doi:10.1016/j.gde.2017.01.016 (2017).


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